ELISA檢測(cè)結(jié)果不理想的原因?

ELISA作為經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法，看起來(lái)很平常，然而真正做好它并不容易。BUNSEN本生專(zhuān)注科研試劑盒的研發(fā)及銷(xiāo)售多年，涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，滿(mǎn)足您實(shí)驗(yàn)所需，以實(shí)現(xiàn)與客戶(hù)的雙贏，完善的庫(kù)存及供應(yīng)體系以及高效穩(wěn)定的專(zhuān)業(yè)技術(shù)，保證產(chǎn)品均能現(xiàn)貨供應(yīng)。有哪些方法可以借鑒呢?恒遠(yuǎn)技術(shù)人員總結(jié)了以下幾點(diǎn)：

一、確定您的樣本類(lèi)型和試劑盒可以兼容

常見(jiàn)樣本類(lèi)型有血清，血漿，細(xì)胞培養(yǎng)上清，如果是廠(chǎng)家實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)的，可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明購(gòu)買(mǎi)使用。

注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應(yīng)的血漿性質(zhì)存在差異，需單獨(dú)確認(rèn)兼容性

二、試劑盒檢測(cè)范圍需要匹配樣本中標(biāo)志物濃度

elisa試劑盒的定量檢測(cè)范圍需參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)低和最高濃度區(qū)間內(nèi)屬于線(xiàn)性范圍，其中的值是可信和可定量的。濃度高于線(xiàn)性范圍的樣品要稀釋到線(xiàn)性范圍內(nèi)來(lái)測(cè)量，而濃度低于線(xiàn)性范圍的樣品，其測(cè)量值不能用于計(jì)算濃度，只能用做參考。有一種常見(jiàn)的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標(biāo)志物的濃度偏低，測(cè)量值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)低值。

三、樣本收集有講究

以血清為例，樣本收集可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，但需注意以下要點(diǎn)。樣本盡量用無(wú)菌管收集，避免細(xì)菌的酶類(lèi)和代謝產(chǎn)品對(duì)結(jié)果的影響。采集過(guò)程要避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)。保存過(guò)程中如有沉淀，應(yīng)離心后取上清液。樣本若不立即測(cè)定，建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃，每次檢測(cè)使用一管，即避免交叉污染和反復(fù)凍融，有能保證檢測(cè)結(jié)果的平行可比性。

四、實(shí)驗(yàn)前要準(zhǔn)備好相應(yīng)試劑

提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境，這個(gè)過(guò)程大致需半小時(shí)左右。洗液是濃縮液，如有結(jié)晶析出，需溶解后再進(jìn)行稀釋。A、B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液。為保證蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制質(zhì)量，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，重溶前需將管子離心，加入說(shuō)明書(shū)的緩沖液，慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻，至少 15 分鐘，不建議用槍頭吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分裝后根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存。梯度稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，建議用聚丙烯管(對(duì)蛋白吸附力很低)，每步都要充分混勻且更換新槍頭，確保梯度準(zhǔn)確性。

五、儀器設(shè)備的準(zhǔn)備

相關(guān)設(shè)備包括移液器、洗板機(jī)/搖床和酶標(biāo)儀。移液器的準(zhǔn)確性對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性十分關(guān)鍵，需要確保定期校準(zhǔn)維護(hù)。搖床的使用是為了讓反應(yīng)體系快速達(dá)到平衡，獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果。不用搖床對(duì)實(shí)驗(yàn)通常的影響是，OD 值低，CV 大。酶標(biāo)儀等設(shè)備使用前提前15分鐘開(kāi)機(jī)預(yù)熱。

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